蛋白質(zhì)純化的選擇方法
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的科研人員熟練掌握了分子生物學(xué)的各種試驗技術(shù)，并研制成套試劑盒，使基因克隆表達變得越來越容易。但分子生物學(xué)的上游工作往往并非是zui終目的，分子克隆與表達的關(guān)鍵是要拿到純的表達產(chǎn)物，以研究其生物學(xué)作用，或者大量生產(chǎn)出可用于疾病治療的生物制品。相對與上游工作來說，分子克隆的下游工作顯得更難，蛋白純化工作非常復(fù)雜，除了要保證純度外，蛋白產(chǎn)品還必須保持其生物學(xué)活性。純化工藝必須能夠每次都能產(chǎn)生相同數(shù)量和質(zhì)量的蛋白，重復(fù)性良好。這就要求應(yīng)用適應(yīng)性非常強的方法而不是用能得到純蛋白的方法去純化蛋白。在實驗室條件下的好方法卻可能在大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中失敗，因為后者要求規(guī)?；?，且在每日的應(yīng)用中要有很好的重復(fù)性。本文綜述了蛋白質(zhì)純化的基本原則和各種蛋白純化技術(shù)的原理、優(yōu)點及局限性，以期對蛋白純化的方法選擇及整體方案的制定提供一定的指導(dǎo)。
蛋白純化的一般原則
蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細純化階段二個階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細胞成分如DNA、RNA等分開，由于此時樣本體積大、成分雜，要求所用的樹脂高容量、高流速，顆粒大、粒徑分布寬.并可以迅速將蛋白與污染物分開，防止目的蛋白被降解。精細純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開來，要用更小的樹脂顆粒以提高分辨純化的*步，它可以初步粗提蛋白質(zhì)，去除非蛋白成分。蛋白質(zhì)在硫酸銨沉淀中較穩(wěn)定，可以短期在這種狀態(tài)下保存中間產(chǎn)物，當前蛋白質(zhì)純化多采用這種辦法進行粗分離翻。在規(guī)模化生產(chǎn)上硫酸銨沉淀方法仍存在一些問題，硫酸銨對不銹鋼器具的腐蝕性很強。其他的鹽如硫酸鈉不存在這種問題，但其純化效果不如硫酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來，PEG是一種惰性物質(zhì)，同硫酸銨一樣對蛋白有穩(wěn)定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉淀可通過離心或過濾獲得，蛋白可在這種狀態(tài)下長期保存而不損壞。 蛋白沉淀對蛋白純化來說并不是多么好的方法，因為它只能達到幾倍的純化效果，而我們在達到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質(zhì)的培養(yǎng)基及細胞裂解物中解脫出來。
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